Lip3000转染试剂
Lip3000转染试剂
Lipo3000® Transfection Reagent
货号：ZR029-150 规格：1.5ml
产品简介：
Lipo3000试剂采用了先进的脂质纳米颗粒技术，实现绝佳转染性能和可重复性的结果。其可针对最广泛类型的常见及难转染细胞，实现超高转染效率，同时提供更高的细胞活力。Lipo3000性质温和毒性低优化了转染过程的全部四个步骤，并结合先进的脂质纳米颗粒技术。绝佳的转染性能可以降低所需的试剂量，并降低所有可能对您的细胞系产生毒性的风险。对多种类型的细胞和培养板都具有高转染效率；转染时血清的存在不影响转染效率的优点。
适用范围：贴壁细胞和悬浮细胞（哺乳动物细胞系）的转染。
1) 卓越的转染效率—针对最广泛类型的难转染细胞，可将效率提升3～10倍
2) 作用温和，细胞毒性低—可改善细胞活力
3) 高性价比高，同时实现顶级的转染结果
产品储存： 2-4℃保存一年。（避免冷冻）
细胞转染注意事项： （每次转染一定要进行预实验，来摸索最佳条件，尤其是转染试剂的最佳用量！）
使用方法： DNA的转染和siRNA转染
转染siRNA至细胞中时，完全遵循如上所述的DNA实验方案。
对大多数细胞来说，转染时高的细胞密度可以得到高的转染效率和表达水平，并能减少细胞毒性。
1.接种细胞至70-90%汇合度时转染
2.使用Opti-MEM培养基稀释Lipo3000®-B试剂(建议用2管)，充分混匀
3. 使用Opti-MEM培养基稀释DNA，制备DNA预混液，然后添加Lipo3000®-A 试剂，充分混匀。
4. 在每管已稀释的Lipo3000®-B试剂中加入以上稀释的DNA (1:1比例)。
5. 室温孵育5～15分钟。
6. 加入DNA-脂质体复合物至细胞中。
7. 37℃孵育细胞2 - 4天。然后分析转染细胞。
细胞培养容器 | 96-well | 24-well | 6-well | |
贴壁细胞 | 1～4 × 104 | 0.5～2 × 105 | 0.25～1 × 106 | |
步骤1（建议用2管） Opti-MEM培养基稀释Lipo3000®-B试剂 | Opti-MEM培养基 | 5 μL × 2 | 25 μL × 2 | 125 μL × 2 |
Lipo3000®-B | 0.15和0.3 μL | 0.75和1.5 μL | 3.75和7.5 μL | |
步骤2 Opti-MEM培养基稀释DNA，制备DNA预混液，然后添加 Lipo3000®-A试剂，充分混匀 | Opti-MEM培养基 | 10 μL | 50 μL | 250 μL |
DNA (0.5–5 μg/μL) | 0.2 μg | 1 μg | 5 μg | |
Lipo3000®-A试剂(2 μL/μg DNA) | 0.3～0.4 μL | 1.5～2 μL | 8～10 μL | |
步骤3 Lipo3000®-B试剂中加入稀释的DNA (1:1比例) | 稀释的DNA （步骤2产物） | 5 μL | 25 μL | 125 μL |
稀释的Lipo3000®-B (步骤1产物) | 5 μL | 25 μL | 125 μL | |
步骤3得到混合物即是DNA-脂质体复合物，室温孵育5～15分钟 | ||||
加入DNA-脂质体复合物至细胞中 | 96-well | 24-well | 6-well | |
DNA-脂质体复合物 | 10 μL | 50 μL | 250 μL | |
37°C孵育细胞2–4天。然后分析转染细胞。 | ||||
常见细胞的转染效率（仅供参考，实验条件不同转染效率会有较大差别）
细胞种类 | HEK293 | 293T | 293F | HCT 116 | WRL -68 | HepG2 | NIH/3T3 | THP-1 | Hela | MCF-7 | CHO-S | TS cell | HO1980 | A549 |
转染效率 | >90% | >90% | >90% | >80% | >80% | >80% | >0% | >70% | >80% | >80% | >90% | >70% | >70% | >80% |
细胞种类 | MEF | BE(2)C | CHO | Chok1 | Hep3B | C2C12 | Neuro-2a | HUVEC | MDCK | Hep2C | WEHI | B50 | Calu1 | L929 |
转染效率 | >60% | >80% | >90% | >60% | >80% | >80% | >70% | >80% | >80% | >80% | >80% | >70% | >70% | >70% |
细胞转染注意事项：
细胞/DNA/siRNA每次都不同，建议每次转染一定要进行预实验来摸索最佳条件，尤其是转染试剂的最佳用量！
1) 转染试验失败的原因：DNA/siRNA，转染试剂和细胞。转染效率低要先排除一下是否是siRNA的问题，如果siRNA无效，换再好的转染试剂也没意义，可以用带荧光标记的control siRNA做一下看看，转进去的话会有荧光的。确实转染效率低，可以考虑换转染试剂；毒性大则要减少转染试剂的用量。
2) 细胞的种类和状态影响较大：转染时细胞必须处于良好生长状态，转染时细胞的密度一般铺板率在达到70—80%最好（此时细胞处于对数生长期）；
3) 如果是贴壁细胞，应保证贴壁在12～24小时在进行转染，否则细胞转染容易脱壁。对于贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。
4) 质粒的大小，质量和用量对转染效率很关键。
5) 转染时注意脂质体和用量，过量的话对细胞毒性大也容易失败。
6) 转染作用6小时一定记得要换含血清的培养基。
7) 培养基以及洗涤细胞和稀释用的培养基要无血清、无双抗。
8) 转染试剂对个别细胞可能有一定毒性，在转染过程由于提高细胞的通透性因而不能在培养答基中添加抗生素。
9) 高纯度的DNA或RNA可获得较高的转染效率！用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体对核酸的吸附，影响转染效率。另外，使用脂质体等转染试剂时，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞，引发细胞毒性，导致转染效率降低，故用无血清培养基转染效果更好！
10) 培养基中的血清：在开始准备DNA和转染试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。其实，只要在DNA-转染试剂复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。
11) 培养基中的抗生素：抗生素是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率降低。
12) 一般在转染24-48h，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测实验。
13) 如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素和新霉素等。
14) 建议设置阳性对照和阴性对照。
